Câu chuyện bắt đầu khi Viện bảo tàng Lịch sử Tự nhiên được đóng cửa để trùng tu và nâng cấp, các hiện vật và mẫu tượng tại đây được chuyển đến kho dự trữ liên bang ở Viện Smithosnian nổi tiếng ở Washington. Larry Daley hiện là một nhà sáng chế, kinh doanh lương thiện và không còn làm việc gác bảo tàng ban đêm nữa, nhưng khi biết tin các bạn cũ – tượng Cựu tổng thống Roosevelt và chàng cao bồi Jedediah đang gặp nạn tại nơi ở mới, Daley không ngần ngại thâm nhập vào Smithsonian để giúp một tay. Và một lần nữa, Larry Daley lại trải qua một đêm kinh hoàng tại bảo tàng với sự nổi loạn của các hiện vật tại đây.

Điểm nhấn của phim chính là Viện Smithsonian – một học viện nghiên cứu nổi tiếng của Mỹ, đang tập trung 19 bảo tàng và 9 trung tâm nghiên cứu của thủ đô. Nơi đây đang cất giữ hơn 142 triệu di vật trong các bộ sưu tập, từ chiếc máy bay Amelia Earhart dùng để bay một mình băng qua Đại Tây Dương, đến chiếc áo khoác của Fonzie trong series Happy Days,… và trong số đó, có cả một tên Pharaoh hung tợn, độc ác tên là Kahmunrah, kẻ liên tục gây xung đột với các hiện vật khác như tượng Franklin D. Roosevelt, Dexter, Al Capone,… và đang âm mưu trốn thoát khỏi bảo tàng, thôn tính thế giới. Amelia Earheart đã ra sức giúp đỡ Daley chống lại trò ma quỷ của Kahmunrah và cùng anh cố gắng đặt các hiện vật lại đúng vị trí của mình trước khi trời sáng. Với quy mô to lớn của Smithsonian và số lượng hiện vật khổng lồ mà nơi này đang lưu giữ, nhiệm vụ lần này của Daley xem ra rắc rối hơn và nguy hiểm hơn lần trước rất nhiều.